Skip to content

Długoterminowe badanie replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C w nie-A, nie-B zapaleniu wątroby cd

2 tygodnie ago

476 words

Białka usunięto przez ekstrakcję fenolem-chloroformem w 65 ° C przez 30 minut, a następnie dwie ekstrakcje w temperaturze pokojowej: jedną z fenolem-chloroformem i jedną z samym chloroformem. Po wytrąceniu izopropanolem, osad RNA ponownie zawieszono w 9 .l wody potraktowanej pirowęglanem dietylowym i ogrzewano w temperaturze 65 ° C przez dwie minuty w celu denaturacji RNA bezpośrednio przed odwrotną transkrypcją. Reakcja odwrotnej transkryptazy i testowanie PCR
Syntezę komplementarnego DNA przeprowadzono w objętości 20 .l zawierającej matrycę (9 .l roztworu próbki RNA), 40 jednostek inhibitora rybonukleazy (Promega Biotech, Madison, Wis.), 50 .l startera odwrotnego, 80 jednostek odwrotna transkryptaza wirusa ptasiej mieloblastozy (Promega), mmol każdej z czterech DTP (Pharmacia) i bufor PCR (10-krotny bufor PCR składa się z 10 mmol TRIS-kwasu solnego [pH 8,3], 50 mmol chlorku potasu i 2,5 mmol chlorek magnezu). Mieszaninę reakcyjną inkubowano w 43 ° C przez 60 minut. Komplementarny produkt DNA gotowano przez pięć minut, schłodzono na lodzie, zamplifikowano w całkowitej objętości 100 .l zawierającej 50 pmoli każdego zewnętrznego primera, 2,5 jednostki polimerazy Taq (Perkin-Elmer Cetus) i bufor PCR, a następnie nałożono z 100 .l lekkiego oleju mineralnego (Sigma, St. Louis). Reakcję przeprowadzono przez 35 cykli, w tym denaturację w 94 ° C przez jedną minutę, przyłączanie starterów w 45 ° C przez dwie minuty i wydłużanie startera w 72 ° C przez trzy minuty, w programowalnym termocyklerze DNA (Perkin-Elmer Cetus). , Norwalk, Conn.). Po pierwszym etapie amplifikacji 10 .l produktu PCR amplifikowano przez 35 cykli z odpowiednią wewnętrzną parą starterów. Do drugiej reakcji PCR używaliśmy tych samych warunków opisanych dla pierwszej reakcji PCR. Po drugiej amplifikacji, 10 .l produktu PCR analizowano przez elektroforezę na 2% żelu agarozowym i wizualizowano za pomocą fluorescencji w ultrafiolecie po barwieniu bromkiem etydyny.
Ocena wrażliwości i swoistości
Aby ocenić czułość naszej zagnieżdżonej techniki PCR, przeanalizowaliśmy 10-krotne seryjne rozcieńczenia referencyjnej próbki osocza pobranej od Pacjenta 3, u którego wykazano, że inokulum zawiera 106, 5 50% dawki infekcyjnej szympansa na mililitr HCV 15 (i Purcell RH: niepublikowane dane). Sekwencje HCV wykryto w rozcieńczeniu 10-7, ale nie znaleziono ich w rozcieńczeniu 10-8. Dane te wskazują, że czułość naszego testu była mniejsza niż jedna 50-procentowa dawka infekcyjna szympansa.
Aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia naszych próbek produktami PCR, podjęto szereg środków ostrożności, zgodnie z zaleceniami Kwok i Higuchi.16 Wyniki uznano za prawidłowe tylko wtedy, gdy były zgodne w powtarzających się eksperymentach: wszystkie próbki zostały przetestowane co najmniej dwa razy, oraz wielu zostało przetestowanych trzy lub więcej razy. Swoistość naszego testu PCR potwierdzono przez zastosowanie zagnieżdżonych starterów i częściowe sekwencjonowanie produktów PCR. Do sekwencjonowania fragmenty PCR wycięto z 1% żeli agarozowych i oczyszczono za pomocą Geneclean (Bio 101, La Jolla, CA). Sekwencjonowanie przeprowadzono z użyciem Seąuenase (United States Biochemical, Cleveland), jak opisano wcześniej.17
Wyniki
Wykrywanie sekwencji HCV za pomocą dwóch zestawów starterów
Tabela 1
[podobne: dermatologia estetyczna warszawa, hydronea, kalipoz prolongatum ]